Домашняя биотехнологическая лаборатория — начало +95


Картинка отсюда: https://adonius.club/13358-biblioteka-art.html
Картинка отсюда: https://adonius.club/13358-biblioteka-art.html

Если бы кто-то 3 года назад сказал мне, специалисту по информационной безопасности, инженеру внедрения IT систем, что моя кухня превратится в биолабораторию, а комната - в оранжерею на сотню растений, я бы добродушно рассмеялась ему в лицо и может быть даже покрутила пальцем у виска. 

О том, как из нескольких орхидей возникла целая лаборатория микроклонального размножения, под катом…


Началось всё с нескольких фаленопсисов. Фаленопсис - это такой вид орхидей родом преимущественно из Юго-Восточной Азии, распространенный сейчас в домашнем цветоводстве. Приобрела я их исключительно в декоративных целях для озеленения жилища - мне хотелось создать зелёную стену с красиво свисающими из неё гирляндами цветов. 

Для реализации этой задумки на начальной стадии я приобрела пятнадцать разных сортов. Тогда казалось, что это очень много ????. Сейчас моя коллекция близится к 100, и будь у меня в квартире ещё место, это был бы не предел????.

И вы знаете, когда они начали зацветать, мой внутренний юный натуралист достал шило и начал активно тыкать им пятую точку, транслируя свое неуёмное желание поскрещивать между собой всё это цветущее великолепие и во что бы то ни стало вывести новые, абсолютно эксклюзивные сорта.

И понеслась…

"Зеленая стена"
Фото из личного архива.
"Зеленая стена" Фото из личного архива.

Опылив добрую часть пригодных для этого дела цветков, я принялась ждать созревания орхидных плодов - коробочек с семенами. Зреют коробочки орхидей долго - до полугода и даже больше. У некоторых представителей вида срок созревания семян сравним со сроком вынашивания в утробе матери человеческого детёныша???? - до 9 месяцев. 

Но сидеть, сложа ручки, не пришлось, нужно было основательно подготовиться к созреванию плодов, т.к. вырастить орхидею из семечка не так-то просто, а всхожесть они теряют очень быстро. 

***

Все дело в том, что у орхидей, в частности фаленопсисов, очень мелкие семена, практически микроскопические, как пыль. 

Семена орхидеи под микроскопом. 
Источник: https://ru.dreamstime.com/buccaneer-latest-stock-photos?pg=3
Семена орхидеи под микроскопом. Источник: https://ru.dreamstime.com/buccaneer-latest-stock-photos?pg=3

Следовательно, они содержат ничтожно малое количество питательных веществ, которых катастрофически не хватает для развития зародыша до более менее самостоятельного организма со своим корешком, способным кормиться. В связи с этим в природе для орхидей был придуман сложный, но очень интересный способ развития. Орхидейный зародыш практически сразу, как только он начинает расти, позволяет прорасти внутрь себя микоризообразующему грибу.

При исследованиях этих грибов было выявлено, что это фитопатогенные грибы, отнесенные к роду Rhizoctonia. По сути это плесень, вызывающая такие болезни как корневая гниль сахарной свеклы, черной ножки капусты, с которой борются очень многие аграрии и овощные семеноводы, ризоктониозная гниль хлопчатника, ризоктониоз картофеля и другие. В общем это очень пакостная вещь.

Прорастающий склероций ризоктонии на агар-агаре.
Источник: https://www.apsnet.org/edcenter/foreducators/TeachingNotes/Pages/EasyDemonstrationOfFungalMycelium.aspx
Прорастающий склероций ризоктонии на агар-агаре. Источник: https://www.apsnet.org/edcenter/foreducators/TeachingNotes/Pages/EasyDemonstrationOfFungalMycelium.aspx

"Гифы гриба в контакте с семенем проникают внутрь зародыша и образуют кольца, занимая почти все клетки эмбриона…" Орхидная микориза — Википедия (wikipedia.org)

Проросток орхидеи с хорошим иммунитетом не пускает гриб дальше дозволенного ему предела, и таким образом получается симбиотическая связь между орхидеей и микоризой гриба, последняя в которой не хуже настоящих корней снабжает молодую орхидею водой и растворенными в ней питательными веществами. 

Но не так все радужно. Из нескольких миллионов семян, созревающих в одной коробочке, до взрослых растений доживают всего несколько десятков. Потому что далеко не каждое семя попадает в достаточно влажную и при этом воздушную среду, не каждое семя находит нужные грибы и образует с ними симбиотическую связь. Если у орхидейки вдруг просел иммунитет, то вместо того, чтобы питаться, она сама становится обедом грибницы. В общем вы поняли, все сложно.

***

Конечно же на заре введения орхидей в домашнее цветоводство люди старались воссоздавать для выращивания сеянцев условия, близкие к природным: подходящий субстрат, влажность, освещенность, температуру. Селекционеры пытались выделять штаммы тех самых специальных грибов с корней взрослых растений, культивировали их и пытались "заражать" ими посевы… Но в идеальной искусственной среде плесень жрала все, и выход взрослых орхидей был чуть ли не хуже, чем в природе. 

Поэтому человечество озаботилось поиском более продуктивных способов снабжения орхидных сеянцев необходимыми питательными веществами - напрямую, без участия грибов.

Логичным решением, которое пришло в голову американскому ботанику Льюису Кнудсону, было использовать для "вскармливания" орхосеянцев специальную смесь, содержащую все необходимые минеральные вещества и простые сахара, растворенные в воде. А чтобы семена не тонули, смесь он сделал желеобразной с помощью загустителя агар-агара. Такая смесь очень похожа на микробиологическую, на которой культивируют штаммы различных бактерий и грибов, и соответственно очень приходится им по вкусу. Поэтому, чтобы питательная среда не была сожрана вместе с семенами патогенной микрофлорой, необходимо строго следить за изоляцией посевов от внешнего мира, иными словами - соблюдать стерильность. 

И дело пошло. Такой способ выращивания сеянцев дал очень не плохой результат.

Семена, протокормы и ростки фленопсиса P. aphrodite subsp. formosana на разных стадиях развития. 

Источник: https://www.researchgate.net/figure/The-seeds-protocorms-and-seedlings-of-P-aphrodite-subsp-formosana-at-different_fig1_328606028
Семена, протокормы и ростки фленопсиса P. aphrodite subsp. formosana на разных стадиях развития.  Источник: https://www.researchgate.net/figure/The-seeds-protocorms-and-seedlings-of-P-aphrodite-subsp-formosana-at-different_fig1_328606028

Фамилией Кнудсона назвали питательную среду, на которой он вырастил сеянцы. С тех пор среда Кнудсона считается самой подходящей для этого дела, а такое стерильное микробиологическое вскармливание - чуть ли не единственный эффективный способ выращивания орхидей из семян. Поэтому, пока зрели мои семена, я взялась за комплектацию своей импровизированной домашней лаборатории. 

***

Помимо выращивания орхидей из семян мне было интересно заняться ещё и микроклональным, или меристемным, размножением растений. Меристема - простым языком это конгломерат верхушечных клеток внутри почки растения, из которых будет развиваться побег. Они представляют собой образующую ткань и активно делятся, формируя разные органы растущего побега.

И вот с растения берут одну почку, достают из нее эту самую меристему, сажают её, также как и семена, на стерильную питательную среду и выращивают ее. Важно подобрать подходящий состав среды, чтобы она думала, что она все еще на материнском растении, и ничего страшного не произошло.

Если посадка прошла удачно, меристема начинает делиться. Получается этакая масса неструктурированного биоматериала. В среду добавляют различные гормоны, тем самым инициируя рост тех или иных органов побегов и корней. То есть этот процесс управляемый: одни комбинации веществ побуждают рост побегов вверх, другие вызывают активное разрастание побегов в стороны - кущение, а третьи - дают команду роста корней. Таким образом, воздействуя на разных стадиях разными веществами, выращивают из массы недетерминированных клеток тысячи взрослых растений. 

Схема меристемного способа размножения растений. 
Источник: https://begoniacollection.ru/soderzhanie_begonii/razmnozhenie-begoniy/biotehnologii-meristemnoe-razmnozhenie-rasteniy/
Схема меристемного способа размножения растений.  Источник: https://begoniacollection.ru/soderzhanie_begonii/razmnozhenie-begoniy/biotehnologii-meristemnoe-razmnozhenie-rasteniy/

Звучит как волшебство. Для меня это действительно нечто магически манящее и притягательное. Еще в школе кабинеты биологии и химии вызывали в моей душе трепетное благоговение. И хоть ни химиком, ни биологом я не стала, лабораторная посуда: колбы, пробирки с растениями, дистилляторы, реторты, разноцветные жидкости и питательные среды - все это до сих пор приводит меня в неописуемый восторг.  Поэтому перспектива посвятить этому делу некоторую часть своего времени, внимания и жилплощади не то чтобы не вызвала отвращения, а наоборот была охотно воспринята и с воодушевлением принята к реализации. 

Но вернемся к нашим меристемкам. Описанию преимуществ и недостатков меристемного способа размножения растений можно посвятить целую статью, и это будет лишь повторение уже многократно сказанного. Здесь скажу лишь, что:

  • это очень продуктивный способ вегетативного размножения растений. Из одной почки можно получить тысячи самостоятельных растений, в то время как другие способы вегетативного размножения дают на порядки более скромный результат.

  • в результате меристемного черенкования, как и в результате любого другого вегетативного способа размножения растений, сохраняются сортовые мутации материнского растения, которые не воспроизводятся в потомстве при размножении семенами. Таким образом можно очень эффективно размножить какую-нибудь редкую и интересную мутацию или сортовой признак.

  • этот способ подходит для быстрого размножения редких и исчезающих видов, а также растений, с которых сложно получить семена. 

Единственное - слишком уж этот способ наукоемкий и довольно дорогой, но затраты того стоят. ???? У орхидей частенько возникают интересные мутации, не передающиеся половым путем, которые стоят дорого. К тому же что для семян, что для меристемных черенков организация лаборатории и условия выращивания очень схожи, поэтому одно другому не помешает, а даже органично дополнит. А в условиях грядущего глобального импортозамещения в связи с полным прекращением ввоза посадочного материала из Европы такие компетенции вообще в целом очень полезны для страны.

***

В общем теперь, собственно, об организации моей домашней лаборатории. Первым делом для реализации моих наполеоновских планов необходимо было организовать стерильность на рабочем месте, а для этого нужно было заиметь ламинар.

Ламинар - это сердце любой биотехнологической лаборатории. Это специальный бокс, внутри которого создается ламинарный, то есть с постоянной скоростью и без завихрений, поток стерильного воздуха. Поток дует в направлении от задней стенки бокса к оператору. В этом потоке оператор может совершать стерильные операции без страха заразить среду и экспланты чем-либо из внешней среды.

Принципиальная схема работы ламинара.
Принципиальная схема работы ламинара.

Самый простой фабричный ламинар на 2020 г. стоил больше 300 тысяч рублей, такую сумму я не могла позволить себе потратить на свое хобби, поэтому пришлось озаботиться разработкой собственного такого агрегата.

Это был грандиозный проект, достойный отдельной статьи. Я изучила весь ру и не ру нет на предмет необходимых технических характеристик этого девайса, а также различные принципы его устройства. Люди делают всякое: от маленьких бытовых коробов из пластика с приделанными к ним пылесосами, до огромных и тяжелых конструкций из мебельных щитов с трехступенчатой фильтрацией воздуха промышленными фильтрами.

Мне же хотелось, чтобы мой ламинар был компактный для размещения в однокомнатной квартире, но при этом с удобной и достаточной рабочей площадью. Он должен быть лёгкий, чтобы я могла в одиночку перевезти его на новое место, должен сравнительно приятно выглядеть, поскольку всё-таки созерцать его придется у себя дома каждый день. Должен быть тихий и недорогой. Ну и само собой он должен идеально выполнять свою функцию - создание и поддержание стерильного и ламинарного потока воздуха.

Когда проект был разработан, а все необходимые материалы закуплены, мы закрылись с папой в гараже и примерно через неделю вышли оттуда с готовым ламинаром.

Ламинар своими руками.
Фото из личного архива.
Ламинар своими руками. Фото из личного архива.

Я считаю, прибор получился очень удачный, свою функцию выполняет на 100%, прилично выглядит и не очень сильно шумит. Себестоимость порядка 40 000 рублей (2021 год). Я обязательно напишу подробную статью о том, как это было.

После того как сердце лаборатории забилось, дело осталось за малым: некоторое дополнительное оборудование, лабораторная посуда, технические жидкости и, собственно, сами химические ингредиенты, из которых предстояло варить среду.

Из дополнительного оборудования я сразу прикупила магнитную мешалку для приготовления растворов. Взяла импортную (Китай) модель 78-1 с подогревом. Принцип работы у нее очень простой. По сути это электроплитка с вращающимся под ней магнитным элементом, который заставляет вращаться специальный магнитик, лежащий в стакане с раствором, стоящем на этой самой плитке. Таким образом в жидкости внутри стакана создаётся вращающийся вихрь, перемешивающий все, что в него попадает. И всё это ещё и подогревается. Очень удобная штука - только засыпай ингредиенты, сама перемешивает, сама подогревает. Правда довести воду до кипения мощности не хватает - всего 200 Вт, но до 80 градусов - вполне, и агар в ней расходится отлично.

Магнитная мешалка и другое дополнительное оборудование.
Фото из личного архива.
Магнитная мешалка и другое дополнительное оборудование. Фото из личного архива.

Стерилизацию питательных сред, посуды и инструментов первое время делала обычным кипячением на водяной бане в 5-литровой кастрюле. Но один из экспериментов показал несостоятельность этого метода. При неполном погружении стерилизуемой посуды в воду происходит и не полная ее стерилизация. Горлышки бутылок с дистиллированной водой торчали из кастрюли. В итоге целая партия посаженных на питательную среду почек отправилась в мусорное ведро.

Было очень обидно, и поэтому следующей крупной покупкой стал еще один агрегат - автоклав. 

Автоклав "Вятка".
Фото из личного архива.
Автоклав "Вятка". Фото из личного архива.

Выбор мой пал на 14-литровый автоклав "Вятка" от Производственно-торговой компании Армада. Это самый маленький из их линейки автоклавов. Есть еще на 23 л и на 37 л, но пока на первое время мне хватит и самого маленького. Предназначен такой автоклав для приготовления консервов и домашних заготовок, и для моих целей он тоже подходит отлично. 

Общий язык с ним я нашла не сразу. В стеклянных банках с завинчивающимися крышками среда стерилизуется идеально, ничего не закипает, не выбивает и не деформируется. А вот с пробирками, которые закрываются резиновыми пробками, а также с пластиковыми контейнерами вопрос пока открыт. При закипании среды в пробирке повышается давление и пробку выбивает. В итоге после стерилизации все пробирки открыты - весь процесс насмарку. Посоветовали не плотно закрывать пробирки и надевать на пробки бумажные колпачки на резинке. Они удержат пробку на пробирке при нагреве, а при остывании пробка сама втянется в пробирку. Буду пробовать.

Пластиковые контейнеры подходят не любые. Многие плавятся или деформируются при 120 градусах. Нужны полипропиленовые (PP) или термопластиковые (PET) контейнеры. Заявлено, что они выдерживают соответственно до 160 и 225 градусов без деформации. Я пока в поиске таких контейнеров.

Из измерительных приборов нужны очень точные весы. Для приготовления 1 л питательной среды некоторые вещества измеряются в сотых и тысячных долях миллиграмма, то есть это миллионные доли грамма. У меня не очень точные китайские весы, которые способны ощутить лишь сотые грамма. Приходится изворачиваться и готовить так называемые маточные (или стоковые) растворы большей концентрации, из которых брать уже объем, содержащий необходимое количество нужного вещества.

Также нужен термометр для контроля температуры питательной среды и pH-метр для измерения кислотности растворов. Термометр я взяла стеклянный спиртовой на 150 градусов в магазине химического оборудования, а pH-метр - электронный китайский из магазина продвинутого растениеводства или аквариумистики, точно не помню. В любом случае такой pH-метр можно легко приобрести на любом маркетплейсе. Обязательно к нему нужно прикупить пару разных калибровочных растворов.

По дополнительному оборудованию, пожалуй, все. Хочется, конечно, еще микроскоп, механические дозаторы, ручной осмофильтр для стерилизации методом фильтрования термолабильных (чувствительных к температуре) растворов… Но это уже бантики. Основное - это ламинар, весы и автоклав.

Кстати об осмофильтре. Установила себе бытовой Аквафор под раковину, чтобы под рукой всегда была дистиллированная вода. Хотя дистиллят можно покупать и в магазине автозапчастей, и в Леруа вроде бы продавался, но дома под рукой удобнее.

Из других технических жидкостей, помимо дистиллята, нужны:

  • этиловый спирт 96%, 

  • Белизна (15% раствор гипохлорита натрия), 

  • перекись водорода 3%. 

Спирт использую этиловый. Держу в нем инструменты во время работы в ламинаре, а также обжигаю их на огне спиртовой горелки. Изопропиловый спирт при сгорании образует вредные продукты сгорания и копоть, а этиловый хорошо горит, без запаха. Также спирт идет на протирание рук, поверхностей и стерилизацию эксплантов (почек) при посадке на питательную среду. Выдерживаю почки фаленопсисов в спирте 30 секунд. Затем на 10-15 минут кладу их в раствор Белизны.

Белизна, как и перекись водорода, нужна обязательно свежая. Со временем эти вещества теряют свои бактерицидные свойства. Белизну развожу 50/50 с дистиллированной водой, чтобы получить 7% раствор гипохлорита натрия. При более крепком растворе увеличивается вероятность сильного отравления и гибели эксплантов.

После выдержки в Белизне нужно обязательно минут по 10 промывать экспланты в 2-3 дистиллированных стерильных водах. После этого можно сажать почки на питательную среду. Если все прошло удачно, заражения нет, они будут расти.

Дистиллированная вода также используется для приготовления питательных сред.

Из лабораторной посуды и инструментов мне понадобилось вот что:

  • несколько химических стаканов на разные объемы. Пригодились на 0.5, 1 и 2 л - в них удобно готовить растворы и питательные среды;

  • баночки для стерилизации семян и меристемных почек, а также для инструментов;

  • пара чашек Петри - на них удобно разделывать черенки;

  • много-много стеклянных баночек с завинчивающимися крышками для посевов семян; 

  • ещё больше пробирок с пробками для посадки почек - пробую стеклянные с резиновыми пробками и полипропиленовые с завинчивающимися крышками;

  • штативы для пробирок;

  • воронки разной величины для разлива питательной среды по емкостям;

  • скальпели - расходный материал, быстро тупятся при стерилизации горячим паром. В качестве замены можно использовать лезвия для бритвы с хирургическим держателем;

  • пинцеты - нужны тонкие и длинные, чтобы заходили в пробирки. Ими сажаю почки в пробирки;

  • шприцы на 1-5 мл для отмера небольших объемов растворов микро солей и витаминов из маточных растворов;

  • пипетки для посева семян на питательную среду;

  • спиртовая горелка для обжига инструментов при работе в ламинаре;

  • спреи или пульверизаторы - для распыления стерилизующих растворов по поверхности в целях дезинфекции;

  • марля, фольга для заворачивания инструментов для автоклавирования. Такой сверток удобно переносить в ламинар с сохранением стерильности содержимого;

  • резиновые перчатки, маска, халат.

Ну и последнее и самое важное - это сами химические ингредиенты для приготовления питательных сред. Пока у меня есть все микро и макро соли для приготовления:

  • питательной среды по прописи Кнудсона - это тот самый рецепт, на котором Льюис Кнудсон вырастил орхидеи из семян; 

  • и питательной среды по прописи Мурасиге-Скуга - это самая распространенная среда для введения растений в культуру in vitro. Ее собираюсь использовать в экспериментах по меристемному клонированию.

Химические реагенты для приготовления питательной среды Кнудсона.
Фото из личного архива.
Химические реагенты для приготовления питательной среды Кнудсона. Фото из личного архива.

Также нужен агар-агар и сахароза. Если сахарозу можно заменить обычным сахаром, то пищевой агар не подходит для наших целей. Нужен специальный микробиологический. Он отличается лучшей степенью очистки и существенно улучшает результаты экспериментов, но и стоит он на порядок дороже. Агар - вообще самый дорогой ингредиент из всего списка.

В среду Мурасиге-Скуга по прописи, помимо макро и микро солей, также идут еще и витамины и гормоны. Пока нахожусь в их поиске. Витамины думаю приобретать в аптеках в ампулах. Они не очень дорого стоят и уже расфасованы в форме растворов подходящей концентрации. А вот гормоны придется поискать.

Вообще с приобретением большей части всего этого добра пришлось повозиться. Большинство компаний, которые занимаются распространением химической посуды и химических веществ, работают с юрлицами, пришлось налаживать связи, через кого можно совершать такие торговые операции. Процесс сопровождался некоторой неприятной бюрократией, связанной с обменом документами, с простановкой подписей и печатей на документах, с подтверждением личности для получения товара у транспортной компании и прочее. Реально пришлось просить магазин переоформить заказ в транспортной компании, чтобы та его мне отдала.))) 

С химическими ингредиентами ситуация усложняется тем, что минимальная фасовка нужных веществ составляет 100 г. А для приготовления 1 л среды некоторых веществ, как я уже говорила, нужна всего пара сотых миллиграмма. Вот и считайте)) Найти более мелкую фасовку у меня не получилось, поэтому запаса некоторых веществ у меня теперь на десятки тонн питательных сред.

На маркетплейсах продается одна готовая смесь ингредиентов для приготовления среды Кнудсона, но при более внимательном изучении оказалось, что набор солей в ней странный, не по прописи, а также отсутствует сахароза и агар. Стоит этот набор солей на 2 л среды 500 руб. Я купила ее, чтобы сравнить результаты со средой, которую я сделала сама из отдельных солей.

***

Ну и напоследок расскажу немного о результатах на сегодняшний день.

Коллекция орхидей, как я уже сказала, с 15 штук разрослась до сотни. Из них около 10 видовых фаленопсисов, есть пара первичных гибридов, остальное - популярные гибриды азиатской и европейской селекции. 

С начала 2022 года я сделала на своей плантации уже более 50 перекрестных опылений. Многие не завязались, некоторые отсохли в ходе развития. Сейчас зреют и чувствуют себя довольно хорошо порядка 10-15 коробочек, и я продолжаю опылять вновь зацветающие сорта.

Семенная коробочка Phal. Sesame.
Фото из личного архива.
Семенная коробочка Phal. Sesame. Фото из личного архива.

Сделала несколько посевов уже готовых семян на питательную среду моего приготовления и покупную. И уже есть первые всходы????. 

Родители: мама - видовой Phal. tetraspis green, папа - Phal. Nobby Pacific Sunset.
Фото из личного архива.
Родители: мама - видовой Phal. tetraspis green, папа - Phal. Nobby Pacific Sunset. Фото из личного архива.

Взошли семена, которые мне прислала одна девушка из соцсетей. Она сделала переопыление сортов: мама - видовой Phal. tetraspis green, папа - Phal. Nobby Pacific Sunset. Коробочки зрели 7 месяцев.

Посев был произведен 3 июня. Через месяц, 30 июня, они обозначились и немного зазеленели, сказав, что пошли в рост.

Протокормы фаленопсиса на питательной среде через 4 недели после посева. 
Фото из личного архива.
Протокормы фаленопсиса на питательной среде через 4 недели после посева. Фото из личного архива.

Еще через четыре недели они выглядели уже так, как на фото слева.

Протокормы фаленопсиса на питательной среде через 4 недели после посева (увеличение 10x). 
Фото из личного архива.
Протокормы фаленопсиса на питательной среде через 4 недели после посева (увеличение 10x). Фото из личного архива.

На данный момент всходам уже два месяца. Они немного подгорели за время, пока я была в отпуске. Видимо, было очень жарко без кондиционера в мое отсутствие. Но все равно зеленых пупырышков (протокормов) много, они растут. Очень хочется их вырастить и посмотреть, что получится.

На покупной среде Кнудсона, кстати, всходов так и не получилось ни в одной банке.

***

Также уже пробовала сажать почки фаленопсисов на питательную среду. Пока только занималась подбором правильного времени и концентрации стерилянтов. Пробовала 20 минут выдерживать черенки в перекиси водорода, и более агрессивный способ стерилизации через последовательную выдержку в спирте и в 7% гипохлорите натрия с разным временем экспозиции. Посадка была произведена 3 мая 2022г.

Почки фаленопсиса на питательной среде.
Фото из личного архива.
Почки фаленопсиса на питательной среде. Фото из личного архива.

Перекись водорода показала отрицательный результат - плесень. 15 минут в растворе Белизны - тоже отрицательный результат - отравление и гибель эксплантов. 5 минут в растворе Белизны также дал отрицательный результат в виде отравления, но скорее всего не из-за концентрации стерилянта, а из-за некачественной промывки эксплантов в дистилляте после стерилизации.

Самый хороший результат оказался в третьей банке. Черенки после 10 минутной выдержки в Белизне.

Почки фаленопсиса на питательной среде 7 июня 2022г. через 3 недели после посадки.
Почки фаленопсиса на питательной среде 7 июня 2022г. через 3 недели после посадки.

Один черенок из трех живет до сих пор и даже растит побег. 

Почки фаленопсиса на питательной среде 2 августа 2022г.
Фото из личного архива.
Почки фаленопсиса на питательной среде 2 августа 2022г. Фото из личного архива.
Почка фаленопсиса на питательной среде 2 августа 2022г.
Фото из личного архива.
Почка фаленопсиса на питательной среде 2 августа 2022г. Фото из личного архива.

Возможно стоит пересадить его на новую среду.

***

Далее планирую продолжить эксперименты с подбором стерилянтов. Хочу попробовать более щадящий - 3% раствор гипохлорита натрия, и определиться с временем экспозиции в стерилизующем растворе. Затем буду экспериментировать с разными питательными средами: Кнудсона и Мурасиге-Скуга.

Ну а дальше будут самые интересные эксперименты по подбору сочетания и количества гормонов для развития каллусной (недифференцированной) ткани, размножения и органогенеза эксплантов.

Еще хочу попробовать вырастить растение не из почки, а из части листа или корешка, в общем не из меристемной ткани. Такое тоже возможно. 

Ну и что хочется сказать в завершение. Мне очень интересно. Буду продолжать это дело, чтобы когда-нибудь выйти на серьезный уровень????.




Комментарии (56):

  1. steanlab
    /#24606928 / +9

    Отлично-отлично! Добро пожаловать в мир diyBIO :)
    Ламинар получился очень милый. А Белизну покупайте лучше в магазинах «все для стоматолога», ибо в остальных случаях концентрации плавают от… и до…

    • sbflowers
      /#24607744 / +1

      Благодарю, спасибо за совет!) Попробую

      • SSidelev
        /#24608524 / +1

        А ещё лучше готовить свежий раствор самой ))

        Продаются бытовые электролизеры для приготовления гипохлорита.

  2. ZaOl
    /#24607312 / +7

    Попробуй использовать для стерилизации таблетки ДезТАБ (удобнее будет подобрать необходимую концентрацию). Еще хорошо подойдет доместос. Если используешь обычную белизну или дезТАБ добавляй пару капель Твина или любого ПАВа, даже обычного шампуня. Делай несколько промывок дисстилятом после стерилизации. В режиме используй спирт, доместос. Если зарастает грибами, то можно использовать противогрибковые препараты (а-ля нитрат серебра), если бактериями, то в среду можешь добавить антибиотики (во многих случаях никакая стерилизация от них не спасет, потому-что существуют чудесные внутриклеточные микоплазмы).

    На фото от 2 августа у тебя образуется каллус? ( плохо видно). Если не ошибаюсь около ближнего экспланта бактериальная инфекция (либо фенолы). Я бы рассадил.

    Для клонального микроразмножения орхидей мы использовали поллинарий.

    Чтобы не "увядали" экспланты можешь использовать чашку Петри с увлажненной фильтровальной бумагой после стерилизации (предварительно сухожар, ну или в домашних условиях можно "автоклавировать и стерилизовать" в микроволновке)

    Пробирки можешь закрывать ватно-марлевыми турундами.

    Интересно, что у тебя со световым режимом?

    Посмотри статьи Теплицкая, Митрофанова

    • sbflowers
      /#24607772 / +1

      Большое вам спасибо!

      Обязательно посмотрю статьи.

      Ватно-марлевые пробки - знаю, что они хорошо подходят, но почему-то не хочется с ними возиться.

      Про поллинарий тоже почитаю. Не знаю, что это.

      На фото от 2 августа каллуса вроде бы нет. Просто побег растёт. Бактерия - да, там есть. Вот думаю, что с ней делать. По идее надо как-то перестерилизовать и пересадить, но не знаю, что наверняка сможет с ней справиться, поэтому пока не трогаю. Наверное надо на этапе первоначальной посадки добиваться полной стерильности. Может быть как-то пролечивать материнское растение, купить эксплантов в антибиотиках?...

      ДезТаб тоже посмотрю ???? ещё раз благодарю за интерес и за советы!

      • ZaOl
        /#24608746 / +2

        Тогда можете автоклавировать пробирки (да и колбы), покрытые жесткой фольгой. Вырезаете квадратики, закрываете ими пробирки (фольга бывает разной, обычно продают тонкую, но лучше найти потолще). В процессе работы в ламинарном боксе она может порваться, поэтому дополнительно сделайте заготовку таких квадратиков и простерилизуйте в духовке или автоклаве (предварительно завернув в бумагу). Перед тем как закрывать пробирку "обжаривайте" над горелкой. После закрытия делайте прокручивающее движение обеими руками в противоположных направлениях, чтобы плотно зафиксировать фольгу на пробирке. Отдельно подготовьте пищевую пленку, для этого ее нужно закатать в плотный рулон и нарезать на сантиметровые рулоны, которыми дополнительно нужно заворачивать пробирки в месте фиксации фольги и пробирки. Если бактерия на растущем побеге, то можно конечно попытаться спасти ее, попробуйте добавить антибиотик в среду. Если пересаживаете не забывайте про эффект кондиционирования, соблюдайте соотношение объем среды/эксплант. В большом объеме среды небольшой эксплант зачахнет, т.е. такой один побег лучше отрезать от исходного экспланта и пересадить в пробирку.

        • sbflowers
          /#24608796 / +1

          Да, перед закрытием все горлышки прожариваю. С фольгой попробую

  3. Kirill_V
    /#24607314 / +1

    уважение!

  4. Javian
    /#24607346 / +1

    Похоже вашему отцу нужен зятем Ниро Вульф.

    • vassabi
      /#24607476 / +4

      один Ниро Вульф тут уже есть,

      нужен Арчи Гудвин :)

      • sbflowers
        /#24607784 / +1

        Не представляете, как вы близки к истине. Сообщника-помощника действительно хочется ????

        • Javian
          /#24607934

          Помощником у него Теодор Хорстман, а на Арчи это нагоняло тоску:

          Просмотрев утреннюю корреспонденцию, я занялся данными о произрастании и цветении орхидей. Я их перепечатывал на отдельных карточках, принесенных из оранжереи, делая записи вроде следующей: "27 банок удобрения без следов плесени через автоклав 18 фунтов 18, 4, 61", - я с тоской ожидал звонка либо от Ноэля, либо от Маргот, и даже от их родительницы. Но до одиннадцати, когда вниз спустился Вулф, никто и не позвонил.

          • sbflowers
            /#24607948

            Арчи был его помощником в детективных делах, в основном занятии. Вот я о таком же)

          • vassabi
            /#24608560 / +1

            Тот помощник у него был для цветочков, а нужен для вот таких случаев:

            Когда проект был разработан, а все необходимые материалы закуплены, мы закрылись с папой в гараже и примерно через неделю вышли оттуда с готовым ламинаром.

            что-то нетривиальное сделать (по эскизу автора) руками, подать-принести тяжелое - обязательно нужен помощник!

    • sbflowers
      /#24607778 / +2

      Сомнительный жених???? но коллекция у него впечатляющая????

      • Javian
        /#24608394

        Да и Вульф демонстрирует неприязнь к женщинам во всех романах. В оранжерею пускает только в особых случаях.

  5. NorwayFun
    /#24607408 / +6

    Hi,

    Just read your article. Wonderful, beautiful. Huge respects for building LFH by hand (still struggling with it, even after year of preparations.).

    About chemicals you would need, go at https://phygenera.de/ . They got all vitamins, Agar, PGM's, etc (Also parafilm, you will love to use it for covering things.)

    All the best..

    • sbflowers
      /#24607838 / +3

      Thank you very much????. I will definitely look at this store. The main thing is that there are no problems with payment.????

      • NorwayFun
        /#24608880 / +1

        You're welcome. about other ingedients (which are not on phygenera) and/or if you need some professional hardware/reagents/books, try to look me up, Will be only glad to help even with sending them from EU to you :)

      • NorwayFun
        /#24611452 / +1

        Absolutely np. if you'll struggle finding some clean metal salts, let me know. I think I can help with them.

        NaOCl you can make from Ca(OCl)2 and some sodium carbonate or sulfate or such.

        In case you're worrying precipitating transition metal salts after time (Fe, Mn and Mo tend to do it, along with others). Try to have them already chelated with organics (EDTA/EDDHA/etc) (You can find them on phygenera) or just do them before making solution (quite annoying) (Just make sure chelating agent is not toxic and/or subtract anion mass from main mass, if you do them separately(in MS medium you got EDTA, so if you add MnEDTA, just add less amount of EDTA acid itself)

        You also can try to use some UV-A lamp for desinfection, quite clean and convinient way, if it's not destroying reagents :)

        And one last thing. In case you're struggling with pH, try to add buffers (MES is most popular, imho, but you can experiment/try other ones too).

        P.S. Linux/unix system deployment engineer here :)

        • sbflowers
          /#24614836

          Thanks a lot for the tips!????

          I didn't really understand what "subtract anion mass from main mass" means. What anions are you talking about?
          About the buffers - a good idea) Thanks!

          • NorwayFun
            /#24615206 / +1

            I mean, if your medium already contains EDTA as free acid (usually orchid mediums do this) and you'll be adding MnEDTA as Mn source (not sulfate, as it usually is added), just subtract mass of EDTA anion in MnEDTA from EDTAacid mass of medium.

            • sbflowers
              /#24615276

              That's it, I get it. I just haven't seen medium with free EDTA, so I didn't understand how it could be.

  6. Newm
    /#24607526 / +2

    Пластиковые контейнеры подходят не любые. Многие плавятся или деформируются при 120 градусах. Нужны полипропиленовые (PP) или термопластиковые (PET) контейнеры. Заявлено, что они выдерживают соответственно до 160 и 225 градусов без деформации. Я пока в поиске таких контейнеров.

    PP - похоже на правду, а вот с PET есть сомнения... Давно это было, но насколько помню, захотелось мне фильтрануть парафин, а при комнатной температуре это не сделать, а и запихал его в духовку, выбрав в качестве воронки обрезок от PET бутылки из-под кваса. Результат оказался так себе по причине того, что PP банка из-под сметаны, куда стекал парафин, все выдержала нормально, а вот воронка оказалась существенно меньше и тупо провалилась в эту банку.

    • sbflowers
      /#24607852 / +1

      Возможно. PET я пока не искала целенаправленно и не пробовала. Посмотрим.

      • eugenk
        /#24611322 / +1

        Чашки Петри из PET у меня размягчались в скороварке (примерно 120 градусов). Так что вряд ли.

  7. Sunny-s
    /#24608022 / +1

    Знакомые пакетики из Ленреактива! а с чем именно были проблемы с покупкой? мне в гидропонном ассортименте продают без проблем все, включая нитрат аммония, без проблем как физику.

    • sbflowers
      /#24608220 / +1

      До этого я брала кое-что в Биолоте и где-то ещё. Сейчас да, я уже нашла розничные магазины. Все стало гораздо проще.

  8. Sunny-s
    /#24608030 / +1

    кстати, маточные растворы неплохо готовить сразу абсолютно из всех реактивов, которые могут впитывать атмосферную влагу — потом не сможете отмерять точные количества. Приготовил раствор, записал плотность — и отмеряй потом спокойно по объему, а не по весу.

    • sbflowers
      /#24608228

      И они будут долго храниться?

      • Sunny-s
        /#24608368 / +1

        Неорганика - неограниченно :) с органикой видимо нужно идти на те же ухищрения со стерильностью. В гидре все хранится в маточных растворах, кроме микроэлементов (ибо там органические хелаты).

        • sbflowers
          /#24608504 / +1

          В принципе да. Удобрения же тоже в виде растворов... Спасибо за совет, надо будет попробовать.

        • Vsevo10d
          /#24608530 / +1

          Неорганика даже с определенным количеством ПАВ или ядовитой органики может забобриться за милую душу. Если и советовать такое, то даже простые солевые растворы хранить только в холодильнике, а культуральные среды - открывать и закрывать ТОЛЬКО под ламинаром, горлышки тары стерилизовать и заматывать парафильмом поверх крышки. Желательно, чтобы холодильник для реактивов был отдельный от пищи, чисто по ТБ.

          • Sunny-s
            /#24608630 / +1

            Мои гидропонные маточные растворы (все стандартно - нитраты калия, кальция, аммония, сульфат магния и калия, фосфат калия) - хранятся в пластиковых бутылках под раковиной на кухне, в около-предельных концентрациях натурально годами, без соблюдения стерильности. Фубли в растворах не обнаружено :)

            • Vsevo10d
              /#24608908 / +2

              Ну значит, вы все правильно делаете. Я в свое время успел повидать заросты в растворах PBS, SDS (?!), Tween (!!!), как-то умудрялся позеленеть контур охлаждения насоса хроматографа, который мы заполняли сначала 50% этанолом, потом 10% ацетонитрилом. Так что я привык верить не в достаточно стерильные условия, а в достаточно устойчивую жизнь :)

      • ZaOl
        /#24608768 / +1

        только в холодильнике, лучше делайте небольшие объемы, для солей железа лучше отдельно делать, иначе в осадок выпадет. Нужно будет поискать и скинуть Вам на почту немного материала для облегчения жизни

        • sbflowers
          /#24608812 / +1

          Вот да. Сульфат железа через несколько часов выпадает в осадок и становится не пригоден для использования. Советуют хелатировать, подкислять, подщелачивать... Четкого понимания, как можно его хранить у меня так и не сложилось. Буду благодарна вам за информацию ????????

          • Sunny-s
            /#24609042

            Не знаю, как с орхидеями, но обычные растения есть железо могут только в хелатной форме.

            • sbflowers
              /#24610552

              Как я понимаю, хелатирование - это способ удержать железо в II-валентной форме, которая как раз усваивается растениями. В не хелатной форме оно тоже усваивается, но быстро окисляется до III-валентного и становится недоступно растениям.

              • ru1z
                /#24610700

                Хелатирование — способ удержать в растворимой форме, со степенью окисления строгой связи нет, и хелатирование уж тем более не может предотвратить окисление кислородом.

                Откуда идея про лучшую усваимость железа II растениями, любопытно? Больше похоже на байку, если честно.

                • sbflowers
                  /#24611000

                  Может, вы и правы. Я не видела внятного объяснения по этому поводу. Все форумные домыслы и собственная интерпретация учебников по химии и физиологии растений.

  9. Vsevo10d
    /#24608358 / +4

    Не вижу, в ламинаре есть УФО? Если нет, лучше его завести, особенно учитывая, что у вас не культуральный блок с очищенным воздухом, а просто комната.

    За увлечение респект, единственное что, покупка разнообразной химпосуды и точных весов - это хороший такой красный флаг для ФСКН, поэтому будьте аккуратнее.

    • sbflowers
      /#24608516 / +1

      Да, уфо есть.

      Ого, буду иметь в виду. Спасибо.

    • Sunny-s
      /#24608650 / +2

      Слишком много химических хобби сейчас стало, наоборот, это перестало уже быть красным флагом :) и гидропоника уже не означает выращивания одного-единственного растения, спасибо Меклону ))

  10. Javian
    /#24609036 / +5

    Полуофф. У автора оказался Youtube-канал, где можно увидеть иллюстрации из этой статьи в динамике.

    Например Адская магнитная мешалка в 11:07

  11. Didimus
    /#24610126 / +1

    Помню в советское время видел в подмосковном институте шкафы, заполненные трясущимися колбочками и пробирками с рядами растущих на питательном субстрате микроскопических растений. Так выращивали здоровые саженцы чуть ли не из одной клетки. Растения получались здоровыми и с заданными параметрами. От них получали нужные сельскому хозяйству семена.

    Насколько лет назад видел то же помещение, свет не горит, шкафы выключены...

    • sbflowers
      /#24610582

      Эх... Будем возрождать ту хитрую науку ????

    • steanlab
      /#24610836 / +2

      Я еще сопливым школьником тоже смотрел на окна одного такого института, манили они, крутился часто рядом, потом обнаружил что на свалке рядом огромное количество целых (!) широких и длинных пробирок с каким-то желе (тот кто читал статью выше — уже знает как желе правильно называется). Желе отмывалось на раз-два, пробирки шли для детских опытов (до первых официальных уроков химии оставалось то ли класс, то ли два). Так вот «свет не горит, шкафы выключены» уже пару десятков лет. Имхо больше надежд сейчас на таких как sbflowers, а не на это вот все.
      Будущее за гражданской наукой!

      • sbflowers
        /#24611014 / +1

        Очень приятно ???? Спасибо! За науку нашу слегка обидно...

  12. eugenk
    /#24611310 / +1

    Потрясающе ! Особенно учитывая что этим занимается девушка ! Утащил в закладки, и жду продолжения темы !

    Этиловый спирт я тоже использую. Причем в различных экзотических формах. Сейчас делаю для этого холодильник на мощном элементе Пельтье под 25-литровую банку. Дело в том что саке например должно бродить при температуре не выше 12 градусов. В Японии даже есть поговорка - "Чем холодней зима, тем лучше саке". Некоторые сорта пива готовятся тоже только при низких температурах. Хочу чтобы ящик холодильника так же выполнял функцию стерильного бокса, для работы с чистыми культурами дрожжей и грибком кодзи. Правда думал делать его без продувки, а как перчаточный бокс. Но с продувкой как у Вас наверно будет даже лучше. Кстати не подскажете, как Вы делали для своего ламинара стерилизующий фильтр ???

  13. VoronaDragon
    /#24612980 / +1

    Отличная работа!

    Как биотехнолог, я очень рада, что наша отрасль пополняется не только специалистами, но и энтузиастами!

    От себя добавлю, что в агар для микроклонального размножения добавляют гибереллины и ауксины (преимущественно первые), для более быстрого роста. Так при контаминации растение будет более готово встретить инфекцию)

    Плюс коллега, работающая на микроклонах, вместо щамацючивания в спирте иногда использует что-то вроде опрыскивания или отпаривания спиртом ростков, но я честно не знаю, как она это организовала)

    • sbflowers
      /#24614866

      Тоже очень вам рада) Да, с гормонами тоже обязательно буду пробовать. Пока первые опыты с подбором подходящего способа стерилизации. Было бы интересно пообщаться с вами в личке ????